| 产品名称 | EDU增殖检测试剂盒（绿色荧光，适用细胞爬片） |
| 货号 | SNK-013 |
| 规格 | 50T/200T |
| 简介 | EdU（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine），中文名为5-乙炔基-2'-脱氧尿苷，是一种胸腺嘧啶核苷类似物，在细胞增殖时期，能够代替胸腺嘧啶（T）掺入正在复制的DNA分子中，EdU上的乙炔基能与荧光标记的小分子叠氮化物探针在一价铜离子催化下发生共价反应，形成稳定的三唑环，该反应非常迅速，被称作点击反应（Click reaction），通过点击反应，新合成的DNA会被相应的荧光探针所标记，从而准确的检测细胞的增殖能力。 本试剂盒采用荧光显微镜检测，可以检测细胞爬片，细胞涂片的样本细胞增殖。 |
| 使用方法 | 一、自备试剂及仪器： 1.试剂类： 细胞重悬液：含1%BSA的PBS缓冲液（pH7.2-7.6）； 细胞通透液：0.3%Triton X-100的PBS缓冲液（pH7.2-7.6）； 细胞固定液：4%多聚甲醛的PBS缓冲液（pH7.2-7.6）； 其他：去离子水。 2.仪器耗材类：荧光显微镜、细胞爬片、细胞培养板、移液器及Tip头等。 二、试剂配制 1.Click Additive溶液配制 取1.1 mL去离子水加入到一管Click Additive(220mg)中，混匀至全部溶解。配制后可以适当分装，并于20℃保存。 注：建议使用完一管Click Additive后再配制下一管。如果溶解后有白色物质析出，请上下颠倒多次，待全部溶解后方可使用。如该溶液颜色变成棕色，说明组分的有效成分已失效，请弃用。 2.DAPI工作液配制 取4μL DAPI Reagent(25μg/mL)加入96μL PBS中混匀，稀释25倍，现配现用。 三、实验步骤 1.细胞培养（以6孔板为参考，其他培养孔可根据实验需要进行适当调整。）每孔1x10^5-3x10^6细胞接种于6孔板中，培养至正常生长阶段。 注：细胞接种量，可根据细胞大小、生长速度、以及实验处理周期等调整。 2.细胞干预或者处理：（选做）可以根据实验需要对细胞进行药物或者其他刺激干预处理。 3.Edu和细胞共孵育培养：根据预实验结果，用细胞培养基按比例稀释Edu溶液（SNK-013a），或者按比例在孔板培养液中加入适量的EdU溶液与细胞共同孵育，同时设置不添加EdU组作为阴性对照组。每孔加入配制的稀释后的EdU培养液共同孵育2h，去除旧培养液。 注：a.EdU的标记浓度应根据所用的细胞类型做相应的优化选择，推荐以10μM的EdU初始浓度进行摸索，请提前做预实验确认EdU的最佳使用浓度。b.Edu的浓度与孵育时间有关，短时间孵育宜采用高浓度（10-50μM），长时间孵育宜采用第浓度（1-10μM）。c.孵育时间与细胞生长速度有关，大多数肿瘤细胞系均可以采用2h孵育时间。常见的哺乳动物细胞如HeLa、3T3、HEK293等，细胞周期大约在18-25h，参考孵育时间宜在2h左右。人胚胎细胞的细胞周期约30min，参考推荐的孵育时间为5min；酵母细胞的细胞周期约3h，参考推荐的孵育时间为20min，增殖的神经细胞周期约5天，参考推荐的孵育时间为1天。对于孵育时间小于45min时，建议提高EdU的浓度；孵育时间大于20h时，建议适当降低EdU的浓度。d.EdU稀释液现配现用。 4.固定与通透注： 1)孵育完成后，弃去培养基。 2)每孔加入1 mL含4%多聚甲醛固定，室温孵育15 min后弃去4%多聚甲醛固定液。 3)每孔加入1 mL含3%BSA溶液，充分洗涤3次，每次5 min。 4)吸弃上清，每孔加入1 mL 0.3%Triton X-100溶液进行通透，室温孵育20 min。 5)吸弃通透液，每孔加入1 mL 3%BSA溶液，充分清洗3次，每次5 min。 注意：第二次清洗完成，加清洗液后，加3%BSA溶液浸润孔板，准备进行配置下面的Click反应液体系。 5.EdU荧光检测（本说明书按照六孔板每孔500μL的反应体系） 1)按照说明书顺序及实验样本数或者孔板数量配制标记工作液，并按以下样本数下的各组分比例配置Click反应液体系。  注：本步骤六孔板中每孔的反应体系为500µl的反应混合物。如果是12孔板、24孔板、48孔板、96孔板，每孔的反应的体系则分别为400μL、250μL、150μL、100μL的反应混合物总体积。对于较小的孔，单位培养面积的液体用量已经适当增加，以有效避免液体蒸发可能带来的负面影响。如下以六孔板中的细胞样品为例说明具体的操作方法。以上配置的Click反应液在配置后15min内使用，不宜长时间存放。2)吸弃清洗液，每孔加入上述表格配制的500μL的Click反应液，轻轻摇晃培养板以确保Click反应液均匀覆盖细胞，室温避光孵育30 min。 3)吸弃反应液，每孔加入1 mL的3%BSA洗涤3次，每次5 min。 4)DNA染色：吸弃清洗液，每孔加入500μL DAPI工作液，室温避光孵育5~10min。吸弃DAPI工作液，每孔加入1 mL含3%BSA洗涤3次，每次5 min。 注：DAPI溶液的用量需要根据孔板大小适量调整，以完全覆盖每孔整个底面积为准则。 6.分析检测：在荧光显微镜下选择蓝光（激发波长和发射波长分别为490nm,520nm）和DAPI（激发波长和发射波长分别为350nm,470nm）滤光片观察结果。为防止荧光淬灭，请尽快检测。 |
| 产品组分 | 
注：规格 50 T 指是用 6 孔板进行实验可以检测 50 个样本。EdU (10 mM) 首次使用时需要分装（推荐50μL/小瓶或根据实验需要分装成更少量）。 |
| 存储条件 | -20°C保存，SUNNCELL 488 Azide II需要避光保存。 |
| 保质期 | 1年 |
注意事项：
1.实验结果需用荧光显微镜仪进行检测。
2.荧光物质均易发生淬灭,在进行荧光观察时,尽量缩短观察时间,同时在操作和存放过程中也尽量注意避光。
3.铜离子会影响GFP、RFP、mCherry等荧光蛋白的荧光，因此本试剂盒不适用于带GFP、RFP、mCherry等荧光的细胞检测。
4.本产品仅限于专业人员的科学研究用。
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
