| 产品名称 | Annexin V-EGFP/7-AAD 染色凋亡试剂盒 |
| 货号 | SNK-008 |
| 规格 | 20T/50T |
| 简介 | 磷脂酰丝氨酸（PS）在正常细胞中只存在于细胞膜内侧，而在凋亡早期，PS由细胞膜内侧外翻至细胞膜外侧。AnnexinⅤ是一种分子量为35-36 kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS特异性结合。AnnexinⅤ经过FITC、EGFP或PE标记后，作为荧光探针，即可通过PS特异性结合从而特异性标记凋亡早期细胞。 7-AAD是一种核酸染料，但其不能通过活细胞的完整细胞膜，只能通过凋亡晚期和死细胞的细胞膜，因此只能用来标记凋亡晚期细胞和死细胞。 通过AnnexinⅤ与7-AAD联合标记，再经流式细胞仪或者荧光显微镜检测，就可以确定细胞是正常活细胞、凋亡早期细胞还是凋亡晚期细胞或者死细胞。 |
| 使用方法 | 根据实际检测方法选择操作步骤： 若贴壁细胞只需采用荧光显微镜观察，可以直接在经过实验处理的细胞培养孔内使用PBS润洗2次，加入500µL 1X Binding Buffer，再加入5µL Annexin V-EGFP染色液和5µL 7-AAD染色液室温避光染色15min，最后采用荧光显微镜拍照。 若样本为悬浮细胞或贴壁细胞需要流式检测按以下操作步骤进行： 1.经过实验处理的细胞，若本身为悬浮细胞直接收集细胞悬液，贴壁细胞则需消化（建议使用不含EDTA胰酶消化）并终止后收集细胞悬液； 2.离心机300 g离心5 min后弃上清，收集细胞沉淀，用PBS轻轻重悬细胞并计数； 3.取出1-5×105个细胞，300 g离心5 min后弃上清，再次用PBS重悬细胞1次，离心后弃上清； 4.每个样品加500µL的1X Binding Buffer重悬细胞； 5.加入5µL Annexin V-EGFP染色液和5µL 7-AAD染色液，轻轻涡旋混匀，室温避光染色15min； 6.立即检测，如果不能及时检测，请放冰上避光静置并在1小时内完成检测； 检测方法： 流式细胞检测：流式细胞仪采用EGFP信号检测器检测Annexin V-EGFP荧光，采用7-AAD信号检测器检测7-AAD荧光。 荧光显微镜检测：将步骤5中染色后的样本，涂布在载玻片上，用盖玻片盖住细胞，分别拍照EGFP、7-AAD荧光，两种荧光照片合成在一起（由于活细胞无法染色，建议同时拍摄白光照片并合成，以确定活细胞比例）。 |
| 产品组分 |  |
| 存储条件 | 避光保存，禁止冷冻保存，2-8°C 保存。 |
| 保质期 | 一年 |
注意事项：
1.必须使用活细胞进行检测，不能使用破坏细胞膜完整性的试剂处理细胞。
2.普遍认为7-AAD有潜在致癌风险，操作时注意戴手套操作，避免交叉污染。
3.孵育结束后，应尽量在1h以内检测结果，否则结果可能出现异常。
4.细胞经过消化、离心、清洗后可能会出现凋亡增多的情况，因此必须注意操作尽量轻柔，离心转速和时间尽量低，尤其是贴壁细胞不要消化时间过长导致细胞提前进入凋亡。
5.AnnexinⅤ是Ca2+依赖性的磷脂结合蛋白，因此消化细胞时尽量不要使用含EDTA的消化液，PBS也不要含EDTA等螯合剂。
6.检测贴壁细胞时，建议将诱导凋亡后漂浮在培养液中的死细胞或悬浮细胞收集，与收集的贴壁细胞合并一起检测。否则容易丢失凋亡细胞，导致凋亡阳性率低于实际。
7.荧光物质容易淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间，同时在操作和储存过程中也要尽量注意保光。
8.该产品仅供科研使用，不得用于诊断或临床实验。
