细胞融合技术

(1)原生质体的制备
①植物原生质体的制备由于植物细胞具有细胞壁,所以常用酶解法制备原生质体,即用复合醇制剂,如纤维素酶类、半纤维素酶类、果胶酶类、崩溃醇或蜗牛酶对细胞或组织进行酶解,释放出原生质体。
②动物单细胞的获得动物细胞没有细胞壁,但细胞间存在胶原蛋白、层粘连蛋白等连接物质,因此用胰蛋白酶或胶原酶解离胞间基质,可获得动物单细胞。
(2)原生质体融合 原生质体融合后所形成的融合细胞,含有来自不同亲本的细胞核,因此又称为异核体。植物异核体获得的方法有无机盐诱导融合法、高Ca+-高pH与聚乙二醇结合法、电融合诱导法等,动物细胞融合用的方法主要是灭活的仙台病毒介导法。
无机盐诱导原生质体融合是1972年Carlson发明的方法,并用这个方法获得了第一个体细胞杂种。由于硝酸盐对原生质体有毒害作用,且该法诱导融合频率非常低,目前已很少使用。
聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物,略带负电荷,PEG能促进原生质体融合是华裔加拿大籍科学家高国楠(1974)发现的。高Ca2+-高pH溶液是甘氨酸-NaOH(pH9~10.5)缓冲液与Ca(NO:)z溶液的混合物,PEG与高Ca+-高pH溶液结合使用可以明显提高原生质体的融合频率。

细胞融合

  电融合诱导法是1979年Senda建立的一种原生质体融合技术。当两亲本原生质体位于电融合仪所产生的交流电场中时,瞬间高强度的电脉冲会促使质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变,导致质膜破裂而形成融合体。电融合诱导法具有操作简便、融合率高、对原生质体伤害小的特点。
仙台病毒又称为日本血凝病毒,能够促进动物细胞融合,其作用机理为病毒质膜的融合蛋白可介导病毒与动物细胞表面的受体结合,也可介导动物细胞与动物细胞靠近并发生融合。
(3)杂种细胞的筛选与鉴定 两亲本原生质体进行融合处理后,产生的细胞并不都是杂种细胞。如将烟草与大豆的原生质体融合后,在细胞混合物中不仅有烟草-大豆杂种细胞,还有烟草细胞、大豆细胞、烟草-烟草细胞、大豆-大豆细胞。因此,要对融合后的细胞进行筛选,分离出杂种细胞。常用的方法有机械分离法、互补选择法与双荧光标记选择法等。
机械分离法主要是根据两亲本细胞在形态、色泽上的差异,将细胞接种在带有小格的培养皿中,每个小格中约放2~3个原生质体,在显微镜下就可以找出杂种细胞。
互补选择法即利用杂种细胞与亲本细胞在生理生化性状上的差异,将杂种细胞筛选出来的方法。互补选择法又分为白化互补选择、营养缺陷互补选择、抗性互补选择和代谢互补抑制选择等。
双荧光标记选择法用异硫氰酸荧光素标记原生质体,亲本的一方在荧光显微镜下发出苹果绿荧光,另一方会发出红色荧光,融合细胞则同时发出这两种荧光,再通过微量吸管把融合细胞挑选出来。微量吸管挑选效率低,目前在动物细胞融合中已应用一种荧光活性细胞分类装置(FACS),可以将双荧光标记的细胞融合体从混合群体中自动捡出来。
将融合细胞分离出来之后,接种在特定培养基上进行增殖,再经分化培养长成杂种植株,最后还要对杂种植株进行形态学、细胞学、同工酶或遗传物质等方面的鉴定,以保证获得的植株为真正的杂合体。

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