原代细胞培养，是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，在体外培养，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经胰酶消化，分散成为单个游离的细胞，在人工条件下培养，使其不断地生长及繁殖。今天为大家详细介绍小鼠胚胎细胞原代培养的操作步骤和注意事项。
一、实验材料
①材料：妊娠10~14天的小鼠。
②试剂：75%乙醇、Hank's液、DMEM培养液（含10%FBS和抗生素）、1份0.25%胰蛋白酶加1份0.02%乙二胺四乙酸二钠(EDTA)。
③器材：超净工作台、倒置显微镜、CO2培养箱、离心机、高压灭菌锅、电热干燥箱、酒精灯、分析天平、吸管弯头和直头和胶帽、细胞培养瓶、培养皿、烧杯(100mL)、手术剪、止血钳、镊子、解剖盘、不锈钢筛（100目）、离心管(10mL)、计数板。
二、操作步骤
（1）组织块培养法
①取材将妊娠10~14天的小鼠用引颈处死，然后将其整个浸入盛有75%乙醇的烧杯中5s，取出后放入已经消毒的肾形解剖盘中，用普通手术剪、手术镊在动物躯干中部环形切开皮肤，并将两侧皮肤分别拉向头尾把动物反包，暴露躯干。用眼科剪、眼科镊切开动物腹肌和腹膜，并取出含有胎儿的两侧子宫放入60mm培养皿中，剖开子宫体，取出胎儿，在Hanks's液体内洗去血液、羊水、胎膜等杂物后放入另一培养皿。
②剪切：去除胎儿头，尾及内脏，只留下胎儿四肢及躯干部分，在Hank's液内洗2~3次去除血污后，放入60mm培养皿或青霉素小瓶内，用眼科剪、眼科镊反复将小鼠胎儿剪切成1 mm3的小块。
③接种：用弯头吸管吸取若干组织小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块接种到培养瓶底上，小块相互距离5mm为宜，每25mL培养瓶可接种20~30块。
④黏附培养：组织块放置好后，吸净培养瓶内的培养液，轻轻将培养瓶翻转，使接种组织块的瓶底向上。注意翻转瓶时勿使组织块流动，盖好瓶盖，将培养瓶放置于CO2培养箱内37℃培养2~4 h，使组织块微干并黏着在培养瓶底上。
⑤培养：从培养箱中取出培养瓶，开盖，瓶底向上，从瓶底角部加入1mL完全DMEM培养液；然后缓慢翻转培养瓶，让培养液慢慢覆盖附着于培养瓶底的组织小块，置培养箱中培养。待细胞从组织块游出数量较多时，再补加培养液至约3 mL。
在翻转培养瓶和加液过程中，严禁动作过快产生冲力，使黏附的组织块漂起而造成原代培养失败。若组织块不易贴辟，可而先在瓶辟涂上薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。
组织块培养也可以不用翻转法，即在接种组织块后，向培养瓶内仅加入少量培养液，能保持组织块湿润即可。盖好瓶盖，放入培养箱内培养24 h再补加培养液。
（2）消化培养法
①取材与剪切：同组织块培养法。
②消化：将剪切后的组织小块移入10mL离心管内，加入2mL的0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA组成的消化液，室温下消化15~20 min，期间用吸管吹打数次，并随时吸取少量消化液在显微镜下观察，如发现组织已分散成细胞团或单个细胞。则立即加入8mL含5%FBS的Hank's液终止消化。
③用吸管反复吹打组织块，分散单细胞，用100目不锈钢网筛过滤，收取滤出液，2000r/min离心5min，弃上清液。
④用 Hank's液重悬细胞，2000r/min离心5min后弃上清液；重复漂洗两次，以去除细胞悬液中的细胞碎片等。
⑤用2mL DMEM+10%FBS培养液悬浮细胞，计数并稀释细胞浓度至(1~5)×106个/mL，加细胞悬液入培养瓶。置37 ℃，5%CO2培养箱中静置培养，24 h后，更换新培养液，此后每3天换液1次。
三、注意事项
①消化培养法效率较高，可得到大量的原代细胞用于培养，但操作步骤较多，操作时要特
别注意，以防微生物污染而导致培养失败。
②对于不同的组织需用不同的消化方法，一般而言，胚胎类软组织用胰蛋白酶或EDTA即可得到理想的消化效果，而对于成体组织由于存在大量的细胞外基质，需用胶原酶，有时配
合使用半透明质酸酶会加速消化过程。
③在组织消化过程中要随时取样进行观察，发现组织已分散成细胞团或单个细胞时应立
即终止消化，以免消化过度影响细胞的贴壁生长。
④细胞接种浓度不宜过大，否则会影响贴壁和细胞生长。