原代培养是建立各种细胞系（株）必经的阶段，其是否成功与组织污染与否、供体年龄、培养技术和方法、适宜培养基的选择等多种因素有关。由于原代细胞培养的细胞转化性极小，对病毒敏感性好，因此适应制备疫苗等生物制品；但也存在有潜在外源因子、不能事先检查标本且受供体年龄健康状况的影响而导致批间差异大等缺陷。下面就为大家详细介绍一下鸡胚原代细胞的培养操作步骤以及注意事项。
一、实验材料
①试剂：Hank's液、含10%～20%血清的细胞培养液、碘酊棉、酒精棉、0.25%胰酶。
②器材：超净工作台或生物安全柜、细胞培养瓶、洗耳球。灭菌吸管、平皿、毛细吸管、离心管、剪刀、小镊子、CO2培养箱、倒置显微镜。
二、操作步骤
（1）鸡胚的孵育
受精鸡胚放在蛋托上，大头朝上，放入温箱培养。在温箱底部放上一盘水，温度调至37.8 ℃。
（2）鸡胚的发育过程
①观察方法：将9~12天的鸡胚取出，放入平皿中进行观察。
②鸡胚的发育：采用鸡胚进行细胞培养时，应对鸡胚的发育有一个初步了解。鸡胚的发育是由受精卵开始的。它在通过输卵管时，已开始分裂，当产卵时已在卵黄上部形成一层细胞称为胚盘，在适宜的条件下胚盘继续分裂生长。在发育过程中从卵黄和卵白中获取养料和水分，由于胚体和卵黄分开的缘故，胚胎只通过卵黄带与卵黄相连。发育的早期形成3个胚层，即外胚层、中胚层和内胚层，由此形成的胚胎的各个器官和组织。一般孵育至3天出现尿囊，为直肠侧部分的膨出物，尿囊膜是由内胚层和中胚层构成的。至第4~5天胚体出现羊膜，尿囊膜及绒毛膜层包被。羊膜系由外胚层和中胚层组成，开始时紧贴于胚体上，后来腔内逐渐充满羊水。尿囊膜在生长发育的过程中，与绒毛膜相连而成绒毛尿囊膜，此膜由三层细胞组成：外层为外胚层，内层为内胚层，中间为中胚层，其中有很多血管，有两条主动脉自卵黄囊延伸到此膜中，与此并行有两条主静脉，汇成一较大的尿囊静脉。绒毛尿囊膜是鸡胚的呼吸器官，位于壳膜之内。此膜生长发育很快，第10 天已包围了整个鸡胚，此时鸡胚已出现羽毛，呼吸道的发育在第12~15天出现。胚胎体积逐渐增大时，胚胎腔外体液日趋减少，孵出小鸡时已无胚胎腔外体液。在发育早期，尿囊液及羊水的成分与生理盐水溶液相差无几，12天后羊水的蛋白含量及黏稠度增加，尿囊腔积累了肾脏的排泄物，因此，在12天或13他后，尿囊液由于尿酸盐的存在，使原来透明的液体呈现混浊。尿囊液的酸碱度在7~12天期间呈弱碱性，在孵育的末期为pH 6.0。6~13天鸡胚羊水的平均量为5~10 mL，至13天有时可达10 mL。卵白的水分在发育的最初7天中转移到卵黄囊内，在第16 天卵白转人羊水腔为胚胎所吞食。卵黄在发育时逐渐被一层细胞包围，自12天以后卵黄逐渐干燥，在孵出之后24~48 h，整个卵黄囊被吸入小鸡腹腔内，供维鸡出生后最初几天的营养。
（3）鸡胚原代的细胞培养
①消毒：选9~12天的鸡胚2~3个放入超净工作台中，大头（气室）朝上放置，先用碘酊
棉，消毒气室部位。
②取鸡胚：用镊子剥去头、四肢及内脏，洗2~3次，用Hank's液洗去红细胞，吸去液体。③剪碎鸡胚及清洗：用小剪刀将鸡胚反复剪碎成泥状，加Hank's液，吸入细胞培养瓶，稍静置，让组织下沉,吸去液体。用Hank's液洗2~3次,吸去液体，以去除红细胞等。
④加胰酶：根据组织的多少加人一定量的0.25%胰酶，胰酶的量以将组织块浸泡在胰酶中为适中，一个鸡胚一般加0.25%的胰酶4~5 mL。
⑤消化：用胶塞封紧，轻摇均匀，置4℃冰箱静置过夜或37℃水浴消化1 h。
⑥洗去胰酶：消化完毕后，吸出胰酶，用Hank's液或PBS洗3次以洗去胰酶，吸去洗液后。洗时注意轻摇，如猛烈摇动，会将组织块摇散，吸去洗液后，用营养液将细胞洗出，放入培养瓶。
⑦计数培养：加人适量的完全培养液(10~20 mL)，用吸管反复吹打形成细胞悬液，用细胞计数法，计算每毫升营养液中的细胞数，根据所计算的细胞数，将原液稀释成106个/mL。将稀释好的细胞悬液接种到培养瓶中，一般200 mL培养瓶，放15~20 mL培养液，节约时可放10 mL培养液，培养液的量以覆盖瓶底为适中。
⑧放入37℃ 、5%CO2温箱培养：培养时，培养瓶的盖不要拧得太紧，以不会下掉为度，以便CO2进入。培养1~2天后长成单层细胞，即可应用。
三、注意事项
①全部操作过程应在无菌条件下完成。
②放入5%CO2温箱培养的目的是5%CO2能调节培养瓶中的pH，使之在一个星期或更长时间pH保持不变。