武汉尚恩生物：流式缓冲液全方案专家

流式细胞实验中，除流式抗体外，还需要用到诸多缓冲液，根据不同的应用背景，缓冲液主要功能有保持单细胞悬液状态、屏蔽非特异性结合、促进特异性结合、降低背景等，最终都是为了更好的展现流式结果。缓冲液虽然相对流式抗体并没有那么显著，但一旦使用不当，也可能造成结果不佳甚至完全没有结果的情况，因此了解并合理使用缓冲液，也是流式实验中不可或缺的一环。

染色缓冲液（Saining Buffer）

流式染色缓冲液是流式实验中最常用的缓冲液，主要作用是防止细胞聚集、维持单细胞悬液状态、封闭部分非特性位点以及为流式抗体特异性结合提供合适的环境，除了作为抗体染色时的缓冲液，还可以作为流式抗体稀释液和染色过程中的洗液。染色缓冲液通常是以不含钙镁离子的PBS为基础，添加0.1-1%的牛血清白蛋白（BSA）或1-10%的胎牛血清（FBS），有些还会添加0.1-1%的叠氮化钠（NaN3）作为防腐剂。

分选缓冲液（Cell Sorting Buffer）

分选缓冲液也称为分选介质或鞘液/分选液，主要功能是形成稳定的液流、维持液滴形成与充电的稳定性和作为分选后的收集介质，其需要在分选过程中维持细胞活力和生存率、防止细胞黏附和聚集、防止细胞激活和功能损伤并支持下游应用，是确保分选成功、维持细胞活性和保证细胞满足下游使用的关键组分。分选上样缓冲液通常使用不含钙镁离子的PBS或HBSS为基础，添加1-5%FBS或0.1-1%的BSA，还可以根据需要添加25mM HEPES维持pH、添加2-5mM EDTA防止细胞粘连、添加25-50µg/ml DNAse及1-5mM MgCl₂防止死细胞干扰。分选缓冲液一般不使用含酚红的成分避免酚红影响分选，FBS或BSA也不宜过高以免影响分选。分选后的收集液可以使用分选缓冲液或细胞完全培养基，建议加入双抗避免污染。

红细胞裂解缓冲液（RBC Lysis Buffer）

红细胞裂解液是一类可以裂解红细胞的试剂，大多数商业化或实验室自配的裂解液基于渗透压差原理，确保只破碎红细胞而不影响其他细胞。在使用动物全血、组织匀浆等样本进行流式实验时，通常会含有大量红细胞，过量红细胞会影响目的细胞的检测和收集，因此在此类样品进行实验前需要使用红细胞裂解液预先处理样本。红细胞裂解处理可以有效的提高分析精度和灵敏度、去除背景干扰、简化样本处理，对于红细胞含量比较高的样本是必不可少的试剂。

固定和通透缓冲液（Fixation and Permeabilization Buffer）

在流式细胞术中，固定和通透是两个紧密相连、但目的截然不同的步骤。固定是为了“冻结”细胞状态，在特定时间点将细胞的结构和生化状态永久保存下来；通透是在已固定的、坚硬的细胞膜和核膜上制造可逆的孔道，让大分子的荧光抗体或核酸染料能够进入细胞内部，与靶标结合。固定步骤通常使用1-4%的甲醛（溶于PBS）在室温下孵育10-15分钟，可以杀死细胞并停止所有代谢、活化和信号转导过程，同时通过交联或沉淀蛋白，将靶抗原（尤其是易降解或易内化的抗原）牢固地“锁”在原位，防止其流失或位置改变，还可以保持细胞形态在后续实验过程中不收操作影响。通透步骤使用合适的通透液（常见的通透剂有Triton X-100和皂苷等）处理细胞，通过溶解细胞膜上的脂质双分子层来制造孔洞，从而允许大分子的抗体或荧光染料通过细胞膜或者核膜进入细胞内部。

Fc阻断缓冲液（Fc blocker）

Fc受体是一类广泛表达于多种免疫细胞（如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞、NK细胞、嗜酸性粒细胞、活化T细胞等）表面的蛋白质，在使用此类细胞进行流式实验检测时，需要提前对Fc受体进行封闭以避免其结合流式抗体导致假阳性。阻断液中含有高浓度的、不含荧光标记的、非特异性的免疫球蛋白可以与Fc受体结合，从而避免其在后续实验中结合目的流式抗体继而避免假阳性。

除了以上常用缓冲液外，流式实验中还经常会用到Monocyte阻断液（Monocyte Blocker）、聚合物染料缓冲液（Polymer Dyes Staining Buffer）、串联染料稳定液（Tandem stabilizer）等缓冲液。合理使用缓冲液，可以最大程度降低非特异性结合、提高检出效率、保证实验结果有效性，其作用不容忽视。