当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一方面由于细胞密度过大，细胞与细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止将一方面也会因营养物枯竭和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。因此需要将培养细胞进行分离扩大培养，细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的这个过程称为传代或者再培养。
1.传代标准
传代时间一般通过两个方面进行确定：一是在细胞培养过程中，当培养液由于 ph值下降而呈现黄色时，表明细胞已经达到最大密度，需要换液或进行传代培养；二是观察细胞形态，
健康细胞形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。初代培养的首次传代很重要，是建立细胞系的关键时期。在首次传代时一般要特别注意以下3点：
①细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面之前，不要急于传代。
②原代培养时细胞多为混杂生长，上皮样细胞和成纤维样细胞并存的情况很常见。传代时不同的细胞有不同的消化时间，因此要根据需要，注意观察及时进行处理，并可根据不同细胞对胰蛋白酶的耐受时间不同而分离和纯化所需要的细胞。另外早期传代的培养细胞较已经建系的培养消化时间相对较长。吹打细胞时动作要轻巧，尽可能减少对细胞的损伤。
③首次传代时细胞接种数量要多一些，使细胞能尽快适应新环境有利于细胞生存和增殖。随消化分离而脱落的组织块也可一并传入新的培养瓶。
2.生长周期和传代比例
体外培养技术中所谓的传“代”概念并不等于细胞生物学中“亲代细胞”与“子代细胞”中“代”的概念。传代培养的实质就是分离后再次培养，进行一次分离再培养称之为传一代，传代数可以衡量培养物的培养年龄。
传代是细胞分裂造成的结果，细胞从一次分裂结束到下一次分裂结束为一个细胞周期，分为间期与分裂期两个阶段。细胞周期能准确表示细胞增殖速度。两次细胞分裂之间的时间也可以用细胞世代时间来表示，所以细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。
传代代数与细胞的世代数（增殖代数）并不是同一个概念。在细胞培养时，所说的“第6代细胞”指细胞已经传代6次。以贴壁细胞为例，每传代一次，大概要倍增3~6次，细胞要经历如下生长过程：游离期、贴壁期、潜伏期、对数生长期和停止期（平台期）。当细胞达到平台期时，就要进行传代培养，否则细胞会中毒，发生形态改变，甚至死亡。
培养细胞有密度依赖和接触抑制的特点，细胞浓度过低，不易存活，表现为细胞在达到增长前有较长的滞留期；细胞浓度过高，发生接触抑制后生长迟缓甚至死亡，所以传代比例通常按1:2~1:4的稀释度进行。传代后细胞的接种浓度一般为5x105个/mL。