原代细胞培养的类型

原代培养是指细胞分离之后至第一次传代之前的细胞培养阶段。可分为4个步骤:①获取样品;②分离组织;③解剖或解离组织块;④接种于培养器皿中培养。组织分离之后,原代细胞培养即可分为两种:一种将组织块贴附于适宜的基质中,细胞可自组织块向外迁移生长;另一种是将组织块用机械法或酶消化法处理后获得细胞悬液,接种细胞悬液,其中部分细胞最终将黏附于基质开始生长。对于大多数正常而非转化的细胞,除造血细胞外,为了更有效地生存与增殖,需要黏附于某一平面。而转化细胞,尤其是可转移的动物肿瘤细胞,能够在悬浮状态下增殖。

最常用于组织消化的酶包括胰蛋白酶粗制品、胶原酶、弹性蛋白酶、链霉蛋白酶、裂解酶、脱氧核糖核酸酶、透明质酸酶。这些酶既可单独使用,又可联合使用。例如弹性蛋白酶与脱氧核糖核酸酶用于Ⅱ型肺泡细胞的分离,胶原酶与裂解酶联用,胶原酶与透明质酸酶联用。还有其他非哺乳动物酶类也可用于最初的解离,如胰蛋白酶,一种重组的、来自玉米的胰蛋白酶;TrypLE (Invitrogen),重组的微生物来源的胰蛋白酶以及Accutase和Accumax (Innovative Cell Technologies)。因为粗制品常混杂有其他蛋白酶,所以粗制品通常比精制品更有效,而精制品更具有特异性,并且毒性小。胰蛋白酶和链霉蛋白酶解离效果较强,但会造成细胞损伤;相反,胶原酶和裂解酶解离效果较弱,但对细胞损伤较小。透明质酸酶可以与胶原酶合用以消化细胞间基质。脱氧核糖核酸酶可用来分解由破碎细胞释放的 DNA,因为DNA可减弱蛋白水解作用,并促进再聚合。

虽然各种组织培养要满足不同的条件,但有许多因素是大多数原代培养共同需要的
(1)在取材时需去除脂肪和坏死的组织。
(2)为减小对组织的损伤,需用锋利的器具。
(3)适度离心以去除用于解离的酶。
(4)由于原代培养组织细胞的存活率很低,故用于原代培养的细胞的密度应高于正常的传代培养的细胞密度。
(5)营养丰富的培养基如Ham’s F12比简单的培养基更可取。如果可以添加血清,胎牛血清比牛或马的血清更好,细胞成活率更高。特殊细胞类型的分离可能需要选择性培养基。
(6)与成体组织相比,原代培养时用胚胎组织更易分离,细胞更易存活,增殖速度更快。

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