大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）分离自骨髓；骨髓是机体的造血组织，位于身体的许多骨骼内。成年动物的骨髓分两种：红骨髓和黄骨髓。红骨髓能制造红细胞、血小板和各种白细胞。血小板有止血作用，白细胞能杀灭与抑制各种病原体，包括细菌、病毒等；某些淋巴细胞能制造抗体。因此，骨髓不但是造血器官，它还是重要的免疫器官。骨髓是存在于长骨（如肱骨、股骨）的骨髓腔和扁平骨（如髂骨）的稀松骨质间的网眼中，是一种海绵状的组织，能产生血细胞的骨髓略呈红色，称为红骨髓。出生时，红骨髓充满全身骨髓腔，随着年龄增大，脂肪细胞增多，相当部分红骨髓被黄骨髓取代，最后几乎只有扁平骨骨髓腔中有红骨髓。骨髓基质系统内存在的骨髓间充质干细胞是一种除造血干细胞以外的、具有高度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞，可以向骨、软骨、肌组织、皮肤、脂肪、神经等多种组织分化，因此可以作为组织工程中的种子细胞。在骨髓中，BMSC占骨髓有核细胞总数的0.001%-0.1%，含量极低。骨髓间充质干细胞的体外培养条件要求较高，在培养过程中，受贴壁时间、种植密度、血清含量、培养温度和培养基pH值等条件的影响。
一、实验原理
活细胞在超低温下克服了分子间的热运动，因而可长期保存而不影响活力。在不加任何物质条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加人保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞。储存在-130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。
二、实验材料
①器材：液氮罐、冻存管（塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶）、离心管、吸管、离心机、-70 ℃低温冰箱、超净工作台等。
②试剂：0.25%胰酶、培养基、冻存液（血清:DMSO=9:1）。
三、操作步骤
①选择处于对数生长期的细胞，在冻存前24 h内最好换液。
②用0.25%胰蛋白酶消化细胞，倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。加人与消化液等体积的新鲜培养液。将细胞悬液收集至离心管中。
③1000 r/min离心5 min，弃掉含胰蛋白酶的上清液。
④加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106~1×107个/mL。
⑤将悬液分至冻存管中，每管1mL。
⑥将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。
⑦贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。
⑧将装有细胞的冻存管在4℃下存放30 min，转放-20 ℃冰箱4 h，然后放入-70 ℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氨容器内(-196 ℃)。
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