随着国内流式实验的相关设备和技术逐步发展,流式抗体种类在不断增加,多色标记的各类抗体五花八门。对于相关实验了解不深的实验人员来说,为了达到最佳实验效果,选择一款或者多款适合自己实验需要的流式抗体,需要付出大量时间精力查阅资料、逐一比对。接下来我们一起了解下怎么选择适合自己实验的流式抗体。
一:实验内容确认
明确检测样本种属:首先要做的就是确认实验需要检测的样本是什么种属的(人、大鼠、小鼠还是其他种属),根据样本种属类型选择对应抗体。抗体针对的种属如果选择错误,可能会出现检测阳性弱甚至检测不到的情况。
明确检测靶标:不同研究方向,检测细胞的靶标是不一样的,需要根据自身实验方向,确定要检测细胞的哪些靶标。
明确靶标表达区域:不同的靶标,其可能表达在细胞表面,也有可能表达于胞内。表达于细胞表面的靶标,可以直接选择标记的抗体;表达于胞内的靶标,除了选择抗体外,还需要配套选择细胞预处理试剂(破膜剂)处理细胞。
二:抗体选择
抗体类型:由于实验原理不同,应用于WB、IHC、IF、ELISA、FC的抗体会有区别,应用于流式细胞术的抗体必须使用明确标记可以应用于FC(Flow Cytometry)实验,若抗体应用范围并不包含FC,很可能无法在FC实验中检测出理想的结果。
抗体应用种属:抗体适用的样本种属对于实验至关重要,选择错误的话很可能导致实验整体失败。
抗体克隆号:国内外存在大量流式相关文献,其中有诸多检测抗体标记了相应的克隆号,流式抗体克隆号是识别抗体的唯一“身份证”,选择对应克隆号的抗体会让实验结果更加可信。
三:荧光标记选择
流式抗体配色选择是一项极具挑战的工作,需要对流式细胞仪配置、荧光标记特性、靶标表达情况等多方面因素极其熟悉,才能最大程度避免走弯路,获得最佳实验效果。
流式细胞仪配置:不同流式细胞仪型号、激光器配置、滤光片配置等差异比较大,需要对设备参数进行了解,避免出现配色完成结果发现自己的流式细胞仪激发或者检测不了的尴尬情况。
荧光标记特性:各种不同的荧光物质,其荧光强度、发射光谱会有区别,在需要多色同步检测时,需要尽量避免荧光重叠,比如PE-Cy5与APC的光谱重叠较大,会导致补偿问题,建议使用PE-Cy5.5或PerCP-Cy5.5来避免这种情况,常用的四色荧光组合为:FITC、PE、PerCP-Cy5.5、APC。

靶标表达情况:不同的靶标在细胞表达量不同,表达量低的需要使用荧光更强的标记,表达量较高的可以用荧光强度稍低的标记。
四:同型对照选择
同型对照(Isotype Control)用于消除抗体非特异性结合产生的背景染色,是真正的流式阴性对照。它不仅帮助设定流式细胞仪的电压,还省去复杂的竞争封闭步骤。选择同型对照时,需要选择与检测抗体一致的宿主、抗体亚型、荧光标记的其他抗体,选择一款合适的同型对照,可以有效避免非特异性结合产生的假阳性对实验结果造成的影响。

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