如何精准把握细胞消化时间?

在贴壁细胞培养中,细胞消化是至关重要的步骤,可以说直接影响后续实验的成败。消化时间过长过短都会导致细胞受到损伤,进而出现细胞生长速度减慢,大量漂浮不贴壁,拉丝、空泡等异常形态,甚至细胞死亡的情况。因此把握最佳消化时间是培养细胞的必修课之一。

一、了解细胞贴壁强弱
首先,了解细胞的贴壁的强弱是判断最佳消化时间的基础。不同种类的细胞在贴壁强度是有差异的,如果你对你将要培养的细胞并不了解,可以先去ATCC、上海中科院细胞库等权威细胞库查看消化时间,作为我们的预期消化时间。

二、消化试剂的配方、品牌将影响消化时间
以最常用的胰蛋白酶为例,胰酶浓度越高消化能力越强,添加EDTA也可促进胰酶的消化作用。另外,即使是相同配方的胰酶,因不同厂家生产工艺不同,消化效果也会有差异。因此实际消化时间可能与ATCC等细胞库描述不一样,应该以具体情况确定。

三、细胞部分脱落时即可终止消化
如果你是第一次消化细胞、购买了新的细胞、或者换了消化试剂的品牌,需要摸索一次最佳消化时间,作为以后消化该细胞的标准。以下是确认最佳消化时间的方法,以胰酶为例:
1.加足量PBS润洗细胞1-2次,清除残留的培养基,润洗的PBS也尽量吸干净(培养基中的血清会抑制胰酶活性、残余过多PBS会稀释胰酶,均会影响消化效果);
2.将适量胰酶加入培养器皿,摇晃铺匀后放入37℃培养箱进行消化。随后每隔30秒拿出观察一次,若细胞未发生脱落,则放回培养箱继续消化。(贴壁紧的细胞可以延长时间,1-5min观察一次,或参考权威细胞库提供的参考时间);
3.直到显微镜下可见细胞间隙变大并脱落,将培养器皿对着灯光观察,肉眼可见部分细胞开始滑落,说明消化完成,可以加入完全培养基进行中和(注意贴壁较紧的细胞建议先吸取正在消化的胰酶轻轻吹下细胞,再加终止液)。

四、值得注意的细节
1.细胞变圆但未脱落时建议继续消化,此时吹打细胞可能会导致细胞膜破裂,所以建议细胞能滑落再终止消化,确保细胞是被胰酶消化下来而不是被强行吹下的。
2.强行吹下细胞的损伤比胰酶对细胞的损伤大得多,大部分细胞系对胰酶有一定耐受性,遇到消化不下来的情况可以适当延长时间。
3.PBS仅润洗一次可能还有残余培养基,消化时间将变长。润洗两次一定程度上缩短消化时间。
4.贴壁紧的细胞不宜放置在室温消化。

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