目前具有商业价值的CHO细胞系你了解多少？

细胞株在整个生物制造工艺中有着至关重要的地位，一株高产、稳定的细胞株不仅使得上游生产工艺变得简单，同时还可能有利于降低下游生产工艺的复杂度及整个生产工艺的成本。因此，各大制药公司均对细胞株的选用及稳定细胞株构建非常重视。最近两年，随着行业的逐步成熟，大家开始普遍重视对宿主细胞的选择，除了要求有清晰的历史背景信息外，在选择时还要考虑研发周期、成本以及后期整体的生产成本。
CHO细胞最早由Puck实验室在1957年分离，通过将0.1g中国仓鼠卵巢组织酶解消化获得。
1958年Puke实验室将此连续传代细胞进行重新克隆后，建立了我们现在所用的CHO细胞最原始细胞系。这个最原始的CHO细胞系是脯氨酸缺陷型的，必须在培养基中添加额外的脯氨酸以支持其生长，目前所有已知的CHO细胞系均保留了这个特性。这个最原始的CHO细胞系后来流转到不同的实验室和公司，经过不同的培养、驯化、改造和重新克隆后形成了不同种类的CHO细胞系。这些细胞系虽然都是来源于最原始的CHO细胞系，但由于CHO细胞基因组内在的不稳定性及后续不同实验室的筛选培养条件不同，不同CHO细胞系之间的形态、生长、表达、代谢、甚至基因组都有较大差异，下面就几种常用的CHO细胞系进行描述。
1.CHO-K1
CHO-K1是未经改造的野生型CHO细胞。最初的CHO-K1是在1970年左右，由Puck和Kao的实验室将原始CHO细胞系的一个亚克隆存放于ATCC（CCL-61），并命名。
随后源于ATCC CHO-K1的一个亚克隆在1985年被分离，并保存于ECACC（85051005），并被制药公司和CMO公司用作重组蛋白的表达。最原始的CHO-K1细胞是贴壁培养，并需要添加血清。
Lonza公司从ECACC获得CHO-K1驯化到悬浮无血清培养后，建立CHO K1SV（Lonza，2002）细胞株，并广泛应用于其GS表达平台。
Merck（原SAFC）也是从ECACC获得CHO-K1细胞株，并悬浮驯化至化学成分限定培养基中，形成了CHOZN® CHO K1（Merck，2006）细胞株。
基于CHO-K1细胞的表达平台多采用GS（谷氨酰胺合成酶）筛选系统和/或抗生素筛选系统。两个筛选系统连用，提高筛选效率。目前多个已经上市的治疗性蛋白是基于CHO-K1细胞进行开发生产的。
2.CHO-S
基于原始的CHO细胞系，1973年Thompson实验室分离了一株可用于悬浮培养的CHO细胞，并将此细胞命名为CHO-S。此细胞系在1980年代后期提供给当时的Gibco公司，后者将此细胞驯化至CD CHO培养基中，建库并以CHO-S名称进行推广。
因其能在无血清培养基中悬浮生长，并支持高密度培养，在早期常被用作瞬时表达宿主细胞。此后，相应的GMP细胞库被建立，并支持商业化授权开发。
3.CHO-DXB11
CHO-DXB11（又名DUK-XB11）是由哥伦比亚大学的 Urlaub和Chasin在1970-80年代通过伽马射线诱变的方法获得。
CHO-DXB11细胞的双等位基因中，一个DHFR基因被敲除，另一个DHFR基因仅包含一个错义突变（T137R），这使得此细胞不能有效还原叶酸而合成次黄嘌呤（H）和胸苷（T）。在表达外源重组蛋白时，将外源的DHFR基因和目标蛋白基因同时转染细胞，并通过缺乏HT的培养基进行筛选。
CHO细胞平台上第一个被批准上市的tPA就是采用DXB11做为宿主细胞，并且此宿主细胞被Genentech用于后续的多个商业化产品生产。
4.CHO-DG44
由于DXB11细胞中仅有一个等位基因被敲除，在长期传代过程中，会发生低几率的突变使宿主细胞重新恢复DHFR基因活性，造成筛选压力的下降甚至导致重组蛋白表达量的下降。因此，获得一个双等位DHFR基因完全敲除的宿主细胞成为一个需求。
Chasin实验室先后通过化学诱变和伽马射线诱变，最终在1983年筛选出了双等位DHFR基因敲除的CHO宿主细胞，并命名为CHO-DG44。因为DG44细胞完全缺失了DHFR基因的活性，并且可以无血清悬浮培养，使得筛选和加压过程变得更加有效。
目前多家公司及CDMO企业采用此细胞做为平台进行治疗性蛋白的开发，已经有多个产品进入临床及上市阶段。
5.CHOK1SV GS-KO
Lonza在其CHOK1SV细胞的基础上，与Cellectis 合作并利用后者的Meganucleases技术将CHOK1SV细胞中GS的双等位基因完全敲除，于2012年推出了CHOK1SV GS-KO细胞株。
由于内源性的GS基因被完全敲除，大大提高了筛选效率，缩短了稳定细胞株的开发周期（相比CHOK1SV系统缩短了6周），同时提升了最终克隆的稳定性。基于GS-KO细胞的GS Xceed表达平台除包括宿主细胞株外，还包括相应的质粒及V8培养基系统。
GS Xceed已经在全球用于多个产品的开发，并向全球授权（Lonza一代CHOK1SV不给中国授权）。但由于V8培养基系统相对复杂，多数CHOK1SV/GS-KO客户并未采用其培养基系统。
6.CHOZN GS
Merck（原SAFC）于2006年通过ECACC获得CHO-K1细胞株，并将其驯化至化学成分限定培养基CD Fusion中，然后进行亚克隆建立CHOZN CHO K1细胞系。在此细胞系基础上，通过ZFN（锌指核酸酶）技术敲除GS双等位基因，获得GS缺陷型细胞株CHOZN GS，并于2012年推向市场。
整个平台除细胞株外，还包括质粒、克隆构建阶段用的培养基及流加工艺平台培养基。通过平台化的培养工艺进行细胞筛选，可将稳定细胞株构建及上游工艺开发周期缩减到18个星期。
目前以CHOZN GS做为宿主细胞的多个项目已经在全球多个国家推进到临床实验阶段。
除了上述在工业界应用较多的细胞系外，还有其他一些CHO细胞系也在应用。如在欧洲应用比较多的Selexis公司SURE CHO-M细胞株，其源于ECACC CHO-K1细胞系，并经驯化后获得，Selexis表达平台同时运用MARs元件来提升筛选效率和目标蛋白表达量，运用CHO-M的多个项目已经推进到临床实验阶段并有一个分子获得批准上市。
Horizon的HD-BIOP1（GS Null CHO-K1）也是源于ECACC CHO-K1细胞系，通过rAAV技术将双等位GS基因敲除，获得GS缺陷型细胞，但由于基因编辑实验过程中部分实验关键材料记录不全而引起监管机构的担心，Horizon试图通过全基因组测序来消除监管机构的担心，但由于基因组数据过于庞大以及现在对整个基因组数据的解读尚需时日，目前为止尚未在欧美国家获得临床实验批准。