细胞融合技术

(1)原生质体的制备
①植物原生质体的制备由于植物细胞具有细胞壁,所以常用酶解法制备原生质体,即用复合醇制剂,如纤维素酶类、半纤维素酶类、果胶酶类、崩溃醇或蜗牛酶对细胞或组织进行酶解,释放出原生质体。
②动物单细胞的获得动物细胞没有细胞壁,但细胞间存在胶原蛋白、层粘连蛋白等连接物质,因此用胰蛋白酶或胶原酶解离胞间基质,可获得动物单细胞。
(2)原生质体融合 原生质体融合后所形成的融合细胞,含有来自不同亲本的细胞核,因此又称为异核体。植物异核体获得的方法有无机盐诱导融合法、高Ca+-高pH与聚乙二醇结合法、电融合诱导法等,动物细胞融合用的方法主要是灭活的仙台病毒介导法。
无机盐诱导原生质体融合是1972年Carlson发明的方法,并用这个方法获得了第一个体细胞杂种。由于硝酸盐对原生质体有毒害作用,且该法诱导融合频率非常低,目前已很少使用。
聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物,略带负电荷,PEG能促进原生质体融合是华裔加拿大籍科学家高国楠(1974)发现的。高Ca2+-高pH溶液是甘氨酸-NaOH(pH9~10.5)缓冲液与Ca(NO:)z溶液的混合物,PEG与高Ca+-高pH溶液结合使用可以明显提高原生质体的融合频率。

细胞融合

  电融合诱导法是1979年Senda建立的一种原生质体融合技术。当两亲本原生质体位于电融合仪所产生的交流电场中时,瞬间高强度的电脉冲会促使质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变,导致质膜破裂而形成融合体。电融合诱导法具有操作简便、融合率高、对原生质体伤害小的特点。
仙台病毒又称为日本血凝病毒,能够促进动物细胞融合,其作用机理为病毒质膜的融合蛋白可介导病毒与动物细胞表面的受体结合,也可介导动物细胞与动物细胞靠近并发生融合。
(3)杂种细胞的筛选与鉴定 两亲本原生质体进行融合处理后,产生的细胞并不都是杂种细胞。如将烟草与大豆的原生质体融合后,在细胞混合物中不仅有烟草-大豆杂种细胞,还有烟草细胞、大豆细胞、烟草-烟草细胞、大豆-大豆细胞。因此,要对融合后的细胞进行筛选,分离出杂种细胞。常用的方法有机械分离法、互补选择法与双荧光标记选择法等。
机械分离法主要是根据两亲本细胞在形态、色泽上的差异,将细胞接种在带有小格的培养皿中,每个小格中约放2~3个原生质体,在显微镜下就可以找出杂种细胞。
互补选择法即利用杂种细胞与亲本细胞在生理生化性状上的差异,将杂种细胞筛选出来的方法。互补选择法又分为白化互补选择、营养缺陷互补选择、抗性互补选择和代谢互补抑制选择等。
双荧光标记选择法用异硫氰酸荧光素标记原生质体,亲本的一方在荧光显微镜下发出苹果绿荧光,另一方会发出红色荧光,融合细胞则同时发出这两种荧光,再通过微量吸管把融合细胞挑选出来。微量吸管挑选效率低,目前在动物细胞融合中已应用一种荧光活性细胞分类装置(FACS),可以将双荧光标记的细胞融合体从混合群体中自动捡出来。
将融合细胞分离出来之后,接种在特定培养基上进行增殖,再经分化培养长成杂种植株,最后还要对杂种植株进行形态学、细胞学、同工酶或遗传物质等方面的鉴定,以保证获得的植株为真正的杂合体。

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细胞培养在生产中的应用

(1)植物组织培养
根据植物细胞全能性学说,植物的器官、组织、细胞甚至是去除了细胞壁的原生质体都可以进行离体培养,称为广义的植物组织培养。植物组织培养技术可应用于优良品种的快速繁殖、病毒的脱除、单倍体育种、种质资源的保存及遗传转化等方面,其中离体快繁和脱毒应用最多,效果也最明显。
对于一些常规繁殖困难的植物,通过组织培养不仅大大加快了它们的繁殖速度,而且繁殖过程不受季节和时间的限制,在短时间内可以获得大量遗传性状一致的幼苗。多种植物如兰花、康乃馨、香蕉、草莓等已经应用于组培工厂化生产中,并取得了良好的经济效益。
许多植物的母体植株受到病毒的侵染后,会通过无性繁殖的方式传递给下一代,造成产量和品质的严重下降,如柑橘的衰退病和黄龙病、葡萄的扇叶病、草莓的病毒病及马铃薯的退化病等曾使许多国家的农业生产遭受巨大的损失。目前还没有治疗植物病毒病的有效药物,但在感病植株大小约为0.3~0.5mm的茎尖中却几乎不存在病毒,因此可以通过微茎尖离体培养来获得脱毒苗,这种方法也已应用到实际生产中。
(2)植物次生代谢产物生产
随着野生植物资源的破坏和日益短缺,通过传统的分离提取方法制备食品添加剂、杀虫剂、精细化工产品等次生代谢产物已满足不了市场的需求,利用植物细胞生物反应器大规模培养技术生产产品成为缓解这一矛盾的有效途径。如从红豆杉悬浮细胞培养液中可提取抗癌药物紫杉醇;从紫草细胞中可以提取治疗烧伤和痔疮的紫草宁;从青蒿细胞培养物中提取治疗疟疾的青蒿素;培养甜叶菊细胞可提取甜度极高的天然甜味剂,用于食品添加剂;万寿菊的培养细胞中可以分离农药噻吩烷;通过银胶菊液体悬浮细胞大规模生产提取橡胶等。

细胞培养在生产中的应用(3)疫苗和干扰素
疫苗是动物细胞大规模生产技术应用最为成熟的一种产品,是预防乙肝、百日咳、乙脑和狂犬病等传染病的有效药物。根据制备方法不同,疫苗可分为灭活疫苗、减毒活疫苗、基因重组疫苗和核酸疫苗。目前我国生产的乙肝疫苗均为基因重组疫苗,即通过基因工程技术,将乙型肝炎表面抗原的基因片段导入到仓鼠卵巢细胞内,进行细胞大规模培养后,从培养液中分离纯化乙肝表面抗原,然后加入氢氧化铝制成成品。也可构建含有乙肝表面抗原基因的重组质粒,转化到酵母细胞中大量培养,从产物中纯化乙肝疫苗。
干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质,可以从白细胞、成纤维母细胞、T细胞或重组细胞的大规模培养产物中制取。在医学中是治疗慢性乙肝、丙肝等疾病的抗病毒类药物。它本身并不能直接灭活病毒,但糖蛋白具有多种生物活性,在组织细胞受到病毒侵染后,能够调节机体免疫应答系统作用,抑制病毒的复制,使血清转氨酶恢复正常,达到治疗的目的。
(4)干细胞
干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞,包括胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞指具有分化发育为几乎所有类型组织和细胞能力的细胞,主要由早期胚胎中获得,所以在伦理方面存在很大争议,目前只处于实验研究阶段。成体干细胞指成体组织内具有分化成一种或一种以上类型组织和细胞能力的未成熟细胞,虽然成体干细胞只能分化为特定的细胞或组织,但由于来源丰富,体外诱导条件也相对成熟,因此在临床治疗中得到了广泛的应用。
干细胞经过培养后分化形成的特异细胞,可以用于组织和器官的修复再生。如用神经干细胞治疗神经变性疾病帕金森综合征,用胰岛干细胞治疗糖尿病,利用心肌干细胞修复坏死的心肌等。此外,通过胚胎干细胞和基因治疗相结合的技术,可以矫正缺陷基因。当发现早期胚胎由于某种基因的缺陷将会导致基因缺陷病时,就可以收集部分胚胎干细胞,通过基因工程技术用正常的基因取代干细胞中的缺陷基因,再将修复的胚胎干细胞嵌入到胚胎中,可以生产出正常的婴儿。由于干细胞可以治疗多种传统医学方法不能治疗的疑难杂症,因此成为生命科学中的一个研究热点,有着广泛的应用前景。

动物细胞培养方法

①动物单细胞的制备动物单细胞制备的方法有酶法、机械法和螯合剂解离法。目前最常用的方法是酶法,即将动物胚胎或幼龄动物的器官、组织取出后,放在含抗生素的平衡盐溶液中,在无菌条件下,用胰蛋白酶或胶原酶解离主要成分为胶原蛋白、层粘连蛋白、纤粘连蛋白和弹性蛋白的细胞间基质,使组织分散,获得单个细胞。
②细胞培养动物细胞培养所用的液体培养基与植物细胞培养所用的培养基在成分上有所不同,条件更为苛刻,培养液中除了含有葡萄糖、氨基酸、无机盐和维生素之外,还需要动物血清。培养液pH7.2~7.4,培养设备为CO。孵箱,温度37℃左右。

动物细胞培养方法

单细胞培养的传统方法有微室培养法、灌注小室培养法、旋转管培养法和平板培养法等。动物细胞微室培养法、平板培养法与植物细胞微室培养、平板培养的方法类似。
灌注小室培养法是将细胞接种于上下两个盖玻片和金属圈密闭形成的小室中,在小室的两侧有液体流入和流出的小口,以保证培养液能够供应的一种较原始的培养方法。
旋转培养法指把动物单细胞接种在管状培养器皿中,然后固定于特定旋转装置上进行培养。该方法可以明显促进培养器皿内外气体的交换。
在动物细胞的大规模培养技术中,除了血液白细胞、淋巴组织细胞和某些肿瘤细胞可以采用悬浮培养之外,其他大部分哺乳动物细胞只有附着在固体或半固体表面才能生长,所以一般采用微载体培养或多孔载体培养等方法,在此不做介绍。

植物细胞培养方法

植物单细胞的制备方法通常有机械法、酶法和愈伤组织诱导法等。
机械法主要是通过机械磨碎的方法来获得游离的单细胞。该方法获得的细胞数量少,效率低,目前在生产中一般不采用这种方法。
酶法是目前获得单细胞最有效也最常用的方法。由于植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶,因此可用纤维素酶和果胶酶等专一性水解 酶对叶片进行解离,从而释放出游离的单细胞。
愈伤组织是指将母体植株的部分接种在特定的培养基 上,培养一段时间后由伤口处长出的一团无规则、均质的细胞群体。愈伤组织中细胞之间的连接比较松散,所以也可以通过愈伤组织的液体悬浮振荡培养获得单细胞。

细胞培养
植物单细胞培养采用的方法有看护培养法、微室培养法和平板培养法等。看护培养法指用一块生长活跃的愈伤组织来看护单个细胞,使其能够生长、增殖的方法。具体方法为将一块愈伤组织接种于灭菌的盛有培养基(培养基主要成分为无机盐类、氨基酸、维生素、糖类、植物生长调节物质、蒸馏水和琼脂等,pH5.8) 的三角瓶中,在其上放置一片无菌滤纸,再将单个细胞接种于滤纸上,封口后放到恒温培养箱进行培养,温度为25'C士2°C。该法培养的细胞易于成活,但不便进行显微观察。
微室培养是先把带有一- 凹穴的载玻片及配套的盖玻片灭菌,然后在无菌条件下,往载玻片凹穴中滴加一.滴单细胞悬浮液,盖上盖玻片,再用熔蜡或四环素膏封口(留通气孔),最后置于恒温箱培养的方法。用该方法培养的单细胞,能在显微镜下清楚地观察到细胞生长和分裂过程中各种细胞器的变化。平板培养法是把细胞与熔化后即将冷凝的琼脂培养基均匀混合,平铺在培养m中进行培养的方法。平板培养广泛地用于细胞、原生质体及其融合产物的培养。细胞和原生质体的培养密度- -般为每毫升1X10^3~1X10^5个。
以上几种方法一般用于植物细胞的小规模培养。为了获得大量有用的植物次生代谢产物,生产中常用全自动控制的大容积生物反应器对细胞悬浮液进行培养,培养的方法包括分批培养和连续培养。分批培养指植物细跑在含有固定体积培养液的容器中进行培养的过程。整个过程中由于养分的不断消耗,细胞生长速度也在不断地发生着变化,表现为明显的由慢到快,再由快到慢,最后死亡的过程,因此整体细胞增殖速度较慢。而连续培养则是在保持培养液体积不变的情况下,伴随着悬浮培养物的流出会流人新鲜的培养液,使得养分得以不断补充的过程。在整个培养期间,细胞生长速度都保持在最大值,增殖速度快。因此,连续培养是实际生产中一种重要的培养方法。
当然,目前在植物细胞大规模培养中仍存在很多问题,如长时间培养易遭到污染、细胞数量增加后会聚集成大团块、生产成本较高等。今后,随着反应器结构和工艺的进一步优化,这些问题应当会得以解决,细胞大规模培养也将会发挥它更大的作用。

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动物细胞培养基的6大物理作用

动物细胞培养基的6大物理作用包括:PH值、缓冲作用、渗透压耐受范围、温度、黏度、表面张力和泡沫。下面为大家具体介绍这些物理作用在细胞培养基的详解。

1.PH
多数细胞系在pH7.4下生长得很好。尽管各细胞株之间,细胞生长最佳pH值变化很小。一些正常的成纤维细胞系在pH 7.4~7.7牛长最好,而一些转化细胞系在pH 7.0~7.4更合适。据报道,上皮细胞可在pH 5.5维持。为确定最佳pH值,最好做一个简单的生长实验或特殊功能分析。
酚红常用作pH指示剂。pH 7.4呈红色,pH 7.0变橙色, pH6.5变黄色, pH 7.6红色中略带蓝色,pH 7.8呈紫色。

2.缓冲
细胞培养基要在两种条件下有一定的缓冲作用:一是开放式培养条件下,CO2的释放引起pH升高;二是细胞在高密度下,转化细胞系大量产生CO2和乳酸,引起pH下降。为了稳定pH值,可以加入缓冲物。
尽管碳酸氢钠缓冲系统在生理pH下的缓冲能力差,但由于它毒性小,成本低,对培养物有营养作用,所以它仍比其他缓冲系统使用得多。HEPES在pH 7.2~7.6缓冲作用比其他缓冲系统强很多,现在广泛采用的浓度是10 mmol/L或20 mmol/L。

3.渗透压
多数培养细胞对渗透压有很宽的耐受范围。人细胞浆的渗透压是约290 mOsm/kg,因而推测这是体外人细胞的最佳值,这与其他细胞不同(如小鼠约是310 mOsm/ kg)。实际上,大多数细胞在260~320 mOsm/kg之间完全可行。更高的渗透压通常会使细胞生长速率减缓,但也可使蛋白产物的合成速率加快。因此,有文献报道可将细胞培养基渗秀压提高到360 mOsm/kg,以提高单克隆抗体产量。

4.温度
温度除了对细胞生长有直接作用之外,也会影响pH。这是因为低温下CO2溶解度增加,缓冲剂的离子化和pKa上的变化,细胞培养基的pH值也随之发生变化。室温下应调节到比36.5 ℃下低0.2个pH单位。第一次配培养基时,最好将培养基加入血清,在36.5℃下和合适的气体条件下培养样品过夜,检查pH。

5.黏度
细胞培养基的黏度主要受血清含量的影响,多数情况下,对细胞生长没有影响。但当细胞悬浮液需要搅拌时(如悬浮培养物被搅拌或者胰蛋白酶消化后解离细胞时),细胞培养基的黏度就是一个重要的影响因素。黏度大,细胞受损小。若在搅拌时细胞受到损害,可以用羧甲基纤维素、聚乙二醇或聚乙烯基吡咯烷酮增加培养基的黏度,减轻细胞损害。在低血清浓度或无血清下,这一点特别重要。

6.表面张力和泡沫
细胞培养基的表面张力可促进培养物贴附到介质上,但很少用某种方法控制它。悬浮培养时,用含5% CO2的空气在含血清培养基中鼓泡,会产生泡沫。加人硅油消泡剂降低表面张力,有助于防止泡沫生成。
泡沫的作用还不清楚。但泡沫会使蛋白质的变性速率增加;如果泡沫达到培养容器的颈部,也增加了污染的危险。泡沫在液面上的破碎过程是能量快速释放的过程,会造成细胞的严重伤害。细胞的轻度疏水性促使细胞在气泡上升过程中向气一液界面聚集,并随气泡上升至液面,在气泡破碎时,加重了对细胞的伤害,如果泡沫很稳定,还会造成泡沫中细胞的营养缺乏。悬浮细胞培养过程中,必须考虑气泡的作用,通常用改变通气方法或加入保护剂的方法来减少对细胞的损伤。

细胞合成培养基的配制步骤及注意事项

虽然各种培养基的组成各有不同,但商品化的干粉型培养基的配制方法大同小异。绝大多数合成培养基的生产都已标准化、商品化,较为常用的培养基可在市场上购得。这种干粉型培养基性质稳定,便于储存、运输,价格便宜,为使用和配制合成培养基带来很大方便。特殊需求也多可在现有合成培养基基础上补加或调整某些成分予以满足。以往实验室自购各个组分,称量后再按一定顺序进行溶解配制的老方法,一方面需购置大量各种各样的成分,而且每种成分用量很少,很难控制和统一;另一方面要精确称量,顺序溶解,步骤繁琐,质量难以保证。因此,自行配制培养基的方法除了因需要而专门配制一些特殊培养基外,大部分已不再使用。

1.配制用品
滤器、微孔滤膜、磁力搅拌器、O2、天平、烧杯、量筒、贮液瓶、瓶塞、注射器、pH计、NaHCO3、培养基、三蒸水、胎牛(小牛)血清、NaOH、 HCI、青霉素、链霉素。

2.配制步骤
①将干粉型培养基溶于欲配制液体总量2/3的三蒸水,冲洗包装袋两次倒入培养液中,加人磁性搅棒并置于磁力搅拌器上充分搅拌,以确保培养基干粉充分溶解。
②按照产品包装说明的要求和实验需要补加 NaHCO3和谷氨酰胺。
③加入抗生素:最终浓度为青霉素100U/mL,链霉素100ug/mL。(一般市售的青霉素为80万单位/瓶,将其溶解于4 mL三蒸水中,每升培养液中加人0.5 mL;市售链霉素为1g/瓶,将其溶解在5mL中,每升培养液加人0.5 mL。)
④加入所需浓度的经56℃水浴灭活的胎牛(或其他)血清,补加三蒸水至最终体积。(目前,血清均经过无菌处理。)
⑤调整培养液pH值:一般情况下市售干粉型培养基溶解后,pH值都有一相对稳定的数值,但某些因素例如配制液体使用的三蒸水、加人不同浓度的血清、采用CO2加压过滤等,有可能使所配制液体的pH有所改变。因此,配制过程中,应强调采用新鲜制备的三蒸水并在加人血清后调整pH值,过滤除菌时宜采用O2加压过滤。常规配制培养液时pH值常略偏碱,可采用HCI溶液进行调整,使用时可将预先配制的HCI溶液逐滴缓慢加入欲调整的偏碱的液体中并搅拌均匀,用pH计或pH精密试纸观察调整结果达到pH7.2~7.4。
⑥将上述溶液用过滤法消毒除菌。所使用的滤器采用0.22 um和0.45 um滤膜各1张,常规高压灭菌消毒。
⑦将经过滤除菌的培养液分装于贴有标签的无菌贮液瓶中,加盖瓶塞,加封75%乙醇浸泡的玻璃纸,4℃存放。

3.注意事项
①配制培养液以及调节培养液pH值所使用的HCl和 NaOH等溶液需新鲜制备的三蒸水,一般于配制当天制备,以保证水的纯度和质量。
②配制培养基的各种器皿都应彻底清洗,烤干后备用。
③培养液配制过程中一般不需加热助溶。
④培养液配制后应进行无菌试验,以检测培养液是否有污染。配制培养液所需血清的质量应保持稳定,同一项实验应尽可能采用同一批号血清。
⑤每批次配制液体数量以使用2周左右为宜,以免时间过长造成营养成分损失。

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